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Duplicazione e Replicazione del DNA

La duplicazione del DNA avviene grazie alla sua caratteristica che viene sintetizzata nel MODELLO DI REPLICAZIONE SEMICONSERVATIVO dove i filamenti del DNA parentale fungono da FILAMENTO STAMPO.

Accanto al modello semiconservativo vennero elaborati in maniera ipotetica altri due modelli: modello conservativo, secondo il quale i filamenti stampo, alla fine della replicazione, avrebbero costituito un filamento “vecchio” mentre i filamenti sintetizzati, la doppia elica “nuova”. E un modello dispersivo secondo il quale solo alcuni pezzetti di filamenti della doppia elica vecchia si andavano a ripresentarci alla fine della sintesi del doppio filamento di DNA  nuovo. Questo poi venne dimostrato con l'esperimento di Meselson e Stahl. Con questo esperimento , attuato su escherichia coli, si misero in coltura DNA  in presenza di azoto 15 e azoto 14, poi in seguito a duplicazione la miscela venne centrifugata per molte ore in modo tale che si venisse a formare un gradiente di conservazione. Quello che ci si aspettava era che il DNA contente azoto 15 affondasse, quello che conteneva sia il 15 che il 14 si trovasse in posizione intermedia mentre quello con azoto 14 galleggiasse. Si verificò che non era assolutamente presente DNA pesante e questo portò ad escludere l'ipotesi conservativa. Si continuo l'esperimento facendo più volte duplicare il DNA e si verificò che man man scompariva del tutto il DNA intermedio e il DNA leggero andava ad aumentare in concentrazione. Questo dunque fece escludere l'ipotesi della replicazione dispersiva e invece confermò quella della replicazione semiconservativa.

la duplicazione avviene in tre fasi:

a) inizio sintesi: separazione della catena parentale con intervento di: polimerasi, topoisomerasi e DBP; sintesi catene figlie con intervento di DNA polimerasi e primasi (primer)

b) allungamento

c) rimozione e risaldamento con intervento di DNA polimerasi I e ligasi.

La duplicazione del DNA avviene in più punti della catena con la formazione di bolle di duplicazione che poi andranno a fondersi e a definire i due filamenti figli. Il punto in cui il DNA si separa viene definito forcella di replicazione. La topoisomerasi avvolge il DNA e lo taglia in un suo punto da dove si inizierà lo svolgimento del DNA. Poi quando il DNA è rilassato la topoisomerasi interverrà nuovamente e riconnette il filamento doppio risanando DNA e doppia elica. Distinguiamo però due tipi di topoisomerasi: topoisomerasi di tipo I che taglia solo un filamento, il quale poi ruota intorno a quello integro e così si svolge; topoisomerasi di tipo II che invece taglia e ricongiunge entrambi i filamenti.

Il DNA si replica sempre SEMPRE in direzione 5'3'.

Le eliche di nuova sintesi vengono polimerizzate da enzimi come DNA polimerasi che per intervenire richiede di 4 desossiribonucleosidi trifosfato (attraverso una prima idrolisi il cui prodotto è: pirofosfato e desossiribonucleosidi monofosfato, liberano un primo pacchetto di energia. Il secondo pacchetto viene poi liberato con l'idrolisi del pirofosfato.), un primer con un gruppo libero 3' OH e importante è la direzione 5'3'.

i due filamenti che vengono replicati contemporaneamente dal DNA polimerasi hanno una differenza sostanziale. Dato che si duplicano in direzione solamente 5'3', avremo un filamento che potrà essere replicato senza problemi (leading chain) mentre l'altro filamento viene duplicato a pezzetti chiamati frammenti di Okazaki per cui avremo una replicazione più lenta e per questo viene chiamato filamento in ritardo (legging chain). Il DNA ligasi ha il compito poi di unire i frammenti, che possono essere ad esempio costituiti dalla rimozione del primer nei vari frammenti di Okazaki.

REPLICAZIONE NEI BATTERI

-inizio della replicazione: l'inizio avviene avviene in corrispondenza del punto di origine denominato oriC che è riconosciuta di una proteina di inizio “dnaA”. L'interazione tra oriC e dnaA determina l'apertura della doppia elica che avviene solitamente in corrispondenza di un sito ricco di A-T. Le elicasi utilizzano ATP per ogni giro. Successivamente alle elicasi intervengono le SSB (proteine che si legano al DNA a singola elica) il cui ruolo è quello di impedire che il DNA si richiuda. In questo caso la topoisomerasi è di tipo II e si chiama girasi che è fondamentale perché allenta la tensione. Sostanze che inibiscono la girasi infatti impediscono anche la duplicazione del DNA.

-L'attività delle polimerasi: gli enzimi che polimerizzano il DNA sono enzimi polimerasi I, II e III. Ma questo prima di passare alla polimerizzazione necessita di un primer, cioè di riconoscere il sito dove iniziare la replicazione. Questo primer è costituito da RNA (anche detto primasi o RNA polimerasi) che appunto viene così chiamato RNA polimerasi che comunque occupa solo lo spazio di 5, 6 nucleotidi. Questo è fondamentale perché riduce di molto gli errori di replicazione in quanto una volta che poi alla fine viene rimosso, verranno a loro volta corretti i vari errori di replicazione. Ovviamente nella legging chain avremo un numero maggiore di RNA polimerasi in quanto ci sono tanti frammenti a differenza della leading chain che ha un filamento solo.

-problemi connessi alla duplicazione per frammenti: una polimerasi non è in grado di unire i frammenti che si trovano nella legging chain, per questo entra in aiuto un altro enzima che è l'enzima ligasi. Le due forcelle di si incontreranno in una regione del cromosoma detta TER. Dato che la DNA polimerasi II abbiamo detto che replica solo nel verso 5'3' ci verrebbe da pensare che nei due filamenti (legging e leading) faccia un doppio lavoro ovvero che replica e poi torna indietro nell'altro filamento. Ma così non è; è stato ipotizzato da uno scienziato Alberts che al momento della replicazione, il filamento stampo formi un ansa in modo tale che la DNA polimerasi replichi contemporaneamente il filamento veloce e quello tardivi nella stessa direzione.

Il meccanismo di replicazione non avviene sempre in modo perfetto m,a c'è una percentuale relativamente significativa di errori. Paradossalmente questi errori si verificano maggiormente nella leading chain ed il “correttore di bozze” è il DNA polimerasi III.

REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI.

I principi generali sono gli stessi delle cellule procariotiche; la differenza sta nel fatto che qui ci sono un po più di problemi legati maggiormente alla dimensione dei cromosomi. Per questo sono presenti più “correttori di bozze” che sono la DNA polimerasi.

Nonostante la lunghezza ragguardevole dei cromosomi, la fare S della sintesi avviene in 6-8 ore. Questo perché su tutto il cromosoma si vengono a formare tantissime bolle replicative denominate REPLICONI o UNIT DI REPLICAZIONE che iniziano la replicazione quasi contemporaneamente, a differenza che nei batteri avevamo solo un'unica bolla di replicazione. Le polimerasi che intervengono vengono denominate con le lettere greche. Ad esempio la beta viene utilizzata nel meccanismi di riparazione del DNA, e tutte tranne quest'ultima hanno replicazione 3'-5' con compito di “correzione di bozze”. Il fattore di replicazione C assieme all'antigene nucleare di proliferazione (processo ATP dipendente) favoriscono lo sloggiamento del complesso primasi/polimerasi alfa e il legame con la polimerasi delta che risulta essere il principale enzima sua sulla leading chain che sulla legging chain. La rimozione degli inneschi avviene grazie all'enzima RNasi H che appunto rimuove l'RNA di inizio.

Lo stato di compattamento della cromatina regola il momento nella fase S in cui debba avere inizio la duplicazione del DNA. La regola è semplice: la eucromatina (è in forma lassamente compatta) viene duplicata prima rispetto all'eterocromatina (forma fortemente compatta) che viene duplicata dopo. Altro problema nella replicazione del DNA negli eucarioti è la replicazione dei telomeri (tratti terminale del cromosoma). I telomeri terminano con un estremità 3' quindi poi nell'appaiamento avremo un'estremità 5' e fin qui è corretto. L'estremità 5' però sarà la parte terminale dell'innesco, quindi dell'RNA che dopo verrà rimosso dalla polimerasi (gaps) (figura 4,17 pagina 162). Così facendo però avremo un continuo accorciamento del cromosoma. Dunque nel 1989 degli scienziati avanzarono l'ipotesi dell'esistenza di un enzima, la telomerasi composta da un enzima TERT e da un piccolo pezzo di RNA TERC che si trova nell'estremità dei telomeri e che costituisce una sequenza più o meno simile in tutte le cellule costituita da brevi ripetizioni. Questo enzima utilizza il suo RNA come stampo per allungare l'estremo 3' in modo da offrire uno stampo più lungo per l'azione della primasi nella sintesi del filamento comp0lementare dall'estremo 5' verso il 3'.

Gli errori che vengono riscontrati nella duplicazione del DNA vengono dette mutazioni. Questo sono dovute sia a condizioni ambiatali che a a carico delle cellule della linea germinale. Queste ultime vengono trasmesse alla progenie. Nonostante comunque la polimerasi corregga gli errori e successivamente questo viene posto ad ulteriori correzioni. Le mutazioni posso avvenire per esempio in seguito ad esposizione ai raggi ultravioletti. Queste provocano legami covalenti fra le basi pirimidiniche impilate su un singolo filamento generando i dimeri di pirimidina. I dimeri di pirimidina vengono rotti da un enzima chiamato fotoliasi che si attiva a lunghezze d'onda della luce visibile intorno a 320-370 nm. Oltre alla riparazione alla luce abbiamo anche una riparazione al buio o anche detta riparazione per scissione. Abbiamo anche la riparazione per correzione di un appaiamento errato tra basi prevede la rimozione di un lungo filamento che include la base mal appaiata. Altri meccanismi di riparazione sono la rimozione di gruppi alchilici dalle basi.

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